Wir erforschen die Prinzipien der molekularen Erkennung in biologischen Systemen mit strukturanalytischen Methoden. Molekulare Wechselwirkungen bestimmen nicht nur die außerordentliche Spezifität von Enzymen oder die Aktivierung von Rezeptoren in der biologischen Signaltransduktion. Sie sind auch der Schlüssel für die strukturbasierte Wirkstoffentwicklung.

Molekulare Erkennung

Molekulare Erkennung eines ATP-Analogons durch das Enzym NTPDase2
Molekulare Erkennung eines ATP-Analogons durch das Enzym NTPDase2

Extrazelluläre Signaltransduktion

Purinerge Signalgebung
Übersicht über die wichtigsten Proteine, die an der extrazellulären Signalwirkung von ATP und seinen Abbauprodukten beteiligt sind

Zusätzlich zu seiner wichtigen zellulären Funktion im Stoffwechsel dient ATP auch als extrazelluläre Signalsubstanz. Es wirkt auf P2X-Rezeptoren, die ligandengekoppelte Ionenkanäle sind und auf die P2Y-Rezeptoren, die G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) sind. Diese Signalwege über ATP und andere Nukleotide werden als purinerge Signalwege bezeichnet.

Extrazelluläre Nukleotide beeinflussen eine Vielzahl kurzfristiger physiologischer Prozesse, darunter die exokrine und endokrine Sekretion, Immunreaktionen, Entzündungen, nozizeptive mechanosensorische Transduktion, Thrombozytenaggregation und endothelvermittelte Vasodilatation. Langfristige (trophische) Prozesse sind die Zellproliferation, -differenzierung, -migration und -tod. Dies sind Prozesse die insbesondere  bei Entwicklungsprozessen und auch der Krebsentstehung eine große Rolle spielen.


Wie bei jedem Signalmolekül muss seine Wirkung mit der Zeit beendet werden. An der Hydrolyse der Nukleotide sind eine Reihe von extrazellulären Nukleotidasen (Ecto-Nukleotidasen) beteiligt. Die NTPDasen dephosphorylieren ATP über ADP zu AMP. Die Ecto-5'-Nukleotidase (e5NT, eN, CD73) katalysiert die Hydrolyse von AMP zu Adenosin. Neben den Rezeptoren sind auch die Ecto-Nukleotidasen attraktive Ziele für eine Wirkstoffentwicklung zum Beispiel für die Krebs-Immuntherapie. Extrazelluläres ATP hat eine immunstimulierende Wirkung. Adenosin dagegen wirkt als Agonist auf G-Protein-gekoppelte P1-Rezeptoren und hat eine immunsuppressive Wirkung.

Publikationen

  • H. Zimmermann, M. Zebisch, N. Sträter (2012)
    Cellular function and molecular structure of ecto-nucleotidases.
    Purinergic Signalling 8, 437-502. doi
Struktur der NTPDase2 (links) und Angriff eines Wassernukleophils auf ATP (rechts).
Struktur der NTPDase2 (links) und Angriff eines Wassernukleophils auf ATP (rechts). Abbildung: Universität Leipzig, BBZ, Strukturelle Analyse von Biopolymeren

Die NTPDasen hydrolysieren ATP zu ADP und ADP zu AMP, jeweils durch Abspaltung der terminalen Phosphatgruppe. Im Menschen gibt es acht homologe NTPDasen, von denen die NTPDasen 1-3 und 8 extrazellulär an der Zellmembran verankert sind. Die NTPDasen 4-7 liegen intrazellulär in Zellorganellen wie dem Golgi und dem ER vor und sind zum Teil an der Hydrolyse von UDP beteiligt, welches aus UDP-glucose bei der Glykosylierung von Proteinen entsteht.

Wir haben die Struktur der NTPDase2 als erste Raumstruktur dieser Enzymfamilie aufgeklärt (Abbildung links). Das Enzym besteht aus zwei Proteindomänen und das ATP bindet im Spalt zwischen diesen Domänen. Eine Strukturanalyse mit AMPPNP als nicht-hydrolysierbares Substratanalog zu ATP zeigte die Bindung des Substrates und führte zu einem Modell für den Reaktionsmechanismus, in dem eine Wassernukleophil die terminale Phosphatgruppe angreift (Abbildung rechts). Auch die Struktur der NTPDase1 (CD39), welches hauptsächlich am Abbau des immunstimulierenden ATP beteiligt ist, konnte von uns aufgeklärt werden.

Später haben wir Strukturen von NTPDasen aus einzelligen pathogenen Mikroorganismen wie Toxoplasma gondii und Legionella pneumophila untersucht. Diese Krankheitserreger exprimieren die NTPDasen, um die Immunantwort des Wirts zu unterdrücken.

Aktuell forschen wir vor allem an intrazellulären NTPDasen und an der Entwicklung von NTPDase-Inhibitoren.

Publikationen

NTPDasen aus Säugetieren

  • Zebisch M, Sträter N.
    Characterization of Rat NTPDase1, -2, and -3 ectodomains refolded from bacterial inclusion bodies.
    Biochemistry 2007; 46, 11945-56. doi
  • Zebisch M, Sträter N.
    Structural insight into signal conversion and inactivation by NTPDase2 in purinergic signaling.

    Proc Natl Acad Sci U S A. 2008; 105(19): 6882-7. doi

  • Zebisch M, Krauss M, Schäfer P, Sträter N.
    Crystallographic evidence for a domain motion in rat nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) 1.
    J Mol Biol. 2012; 415(2):288-306. doi

 

Mikrobielle NTPDasen

  • Krug U, Zebisch M, Krauss M, Sträter N.
    Structural insight into activation of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate diphosphohydrolase by disulfide reduction.
    J. Biol. Chem. 2012; 287, 3051-3066. doi
  • Krug U, Totzauer R, Sträter N.
    The crystal structure of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate diphosphohydrolase 1 represents a conformational intermediate in the reductive activation mechanism of the tetrameric enzyme.
    Proteins 2013; 81, 1271-1276. doi
  • Zebisch M, Krauss M, Schäfer P, Lauble P, Sträter N.
    Crystallographic snapshots along the reaction pathway of nucleoside triphosphate diphosphohydrolases (NTPDases).
    Structure 2013; 21, 1460-1475. doi
  • Krug U, Totzauer R, Zebisch M, Sträter N.
    The ATP/ADP substrate specificity switch between Toxoplasma gondii NTPDases1 and -3 is caused by an altered substrate base binding mode.
    ChemBioChem 2013, 14, 2292-2300. doi

 

Domänenbewegung des humanen 5'-Nukleotidase (links) und Bindung von AMPCP an die E. coli 5'-Nukleotidase (rechts oben) und das humane Enzym (rechts unten). Bild: Universität Leipzig, BBZ-Strukturanalytik

Die Ecto-5'-Nucleotidase, auch als CD73 bekannt, ist Teil der purinergen Signalkaskade, indem sie AMP zu Adenosin hydrolysiert. Dadurch wird der Adenosin-Signalweg über P1-Rezeptoren eingeschaltet. E5NT ist an der Entstehung von chronischen Schmerzen, Hypoxie und Entzündungen beteiligt. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass CD73 bei vielen Krebsarten zur Tumorpromotion und Metastasierung überexprimiert wird. CD73-Inhibitoren sind für die Krebsimmuntherapie von Interesse (siehe Informationen zur Wirkstoffentwicklung auf dieser Webseite).

Durch Untersuchungen an dem humanen Enzym und der homologen 5'-Nukleotidase aus E. coli haben wir die einzigartige Domänenbewegung des Enzyms und den Katalysemechanismus intensiv untersucht. CD73 ist ein dimeres Enzym. Die Domänenbewegung ermöglicht eine Bindung des Substrates an die offene Form und eine Freisetzung der Produkte (Abbildung links). Nur im geschlossenen Zustand ist das aktive Zentrum, welches zwischen den zwei Proteindomänen des Enzyms liegt, vollständig und katalytisch aktiv. Die homologe monomere 5'-Nukleotidase aus E. coli hydrolysiert neben AMP auch ATP und ADP (und andere Nukleotide). Eine kristallographische Bestimmung des Bindungsmodus des nicht-hydrolysierbaren ADP-Analogons AMPCP zeigte einen katalytisch kompetenten Bindungsmodus, in dem die terminale Phosphatgruppe an eines der beiden Zinkionen koordiniert ist, während das andere Metallion ein Wassernukleophil aktiviert (Abbildung rechts oben). Wir postulieren, dass ein ähnlicher Bindemodus der Phosphatgruppe von AMP zur Hydrolyse des AMP führt.

CD73 wird dagegen von ATP und ADP gehemmt. Der beobachtete Bindungmodus von AMPCP an CD73 ist in der Tat ein inhibitorischer Bindemodus (Abbildung rechts unten). Die terminale Phosphatgruppe verbrückt die beiden Metallionen und das Wassernukleophil wurde verdrängt. AMPCP-Derivate haben sich als hervorragende Inhibitoren der CD73 erwiesen. Die Untersuchung des Bindemodus dieser Derivate is Teil der aktuellen Forschung unserer Arbeitsgruppe und in dem Abschnitt zur strukturbasierten Inhibitorentwicklung näher beschrieben.

Publikationen

  • T. Knöfel and N. Sträter. X-ray structure of the Escherichia coli periplasmic 5'-nucleotidase containing a dimetal catalytic site. Nature Struct. Biol. 1999, 6, 448-453.
  • T. Knöfel and N. Sträter. Mechanism of hydrolysis of phosphate esters by the dimetal center of 5'-nucleotidase based on crystal structures. J. Mol. Biol. 2001, 309, 239-254.
  • R. Schultz-Heienbrok, T. Maier and N. Sträter. A Large Hinge Bending Domain Rotation is Required for the Catalytic Function of E. coli 5'-Nucleotidase. Biochemistry 2005, 44, 2244-2252.
  • K. Knapp, M. Zebisch, J. Pippel, A. El-Tayeb, C. E. Müller and N. Sträter. Crystal Structure of the Human Ecto-5'-Nucleotidase (CD73): Insights into the Regulation of Purinergic Signaling. Structure 2012, 20, 2161-2173.
Schema des Aufbaus von Adhäsions-GPCR und Modelle einiger Ektodomänen. Bild: Universität Leipzig, BBZ-Strukturanalytik

Adhäsions-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (aGPCR) sind eine große Rezeptorfamilie, die hinsichtlich ihrer biochemischen, strukturellen und funktionellen Eigenschaften bisher nur teilweise untersucht wurde. Ziel des Projektes ist es, die räumlichen Strukturen der Rezeptoren und ihre Wechselwirkungen mit Bindungspartnern durch Röntgenstrukturanalyse zu charakterisieren. Solche Untersuchungen sind die Grundlage für das Verständnis der molekularen Funktion der Rezeptoren und für eine strukturbasierte Entwicklung von potentiellen Medikamenten, die auf diese Rezeptoren wirken.

Zu diesem Zweck werden die Rezeptoren und Einzeldomänen in drei verschiedenen Expressionssystemen exprimiert: E. coli, HEK-Zellen und Insektenzellen. Für strukturelle und biophysikalische Untersuchungen müssen Milligrammmengen von hochreinem Protein hergestellt werden. Die folgenden Prozesse in der Wirkungsweise der Rezeptoren werden primär untersucht: Die Bindung von Liganden an die extrazellulären Bindungsdomänen und die dadurch induzierten Konformationsänderungen,  die Funktionsweise der autoproteolytischen GAIN-Domäne und die Interaktion zwischen der GAIN-Domäne und dem Transmembranteil, die wahrscheinlich in allen aGPCR konserviert ist.

Adhäsions-GPCR sind ein aktueller Forschungsschwerpunkt in Leipzig. Diese Forschung wird durch eine DFG-Forschungsgruppe und durch den Sonderforschungsbereich Sfb1423 gefördert.

Publikationen

  • D. Arac, N. Sträter, E. Seiradake. Understanding the Structural Basis of Adhesion GPCR Functions
    Handb. Exp. Pharmacol.  2016, 234, 67-82.

Biokatalyse

Proteine als Katalysatoren werden gemeinhin als Enzyme bezeichnet. Der Begriff Biokatalyse wird meist für die Anwendung von Enzymen in der technischen Katalyse (z.B. Enzyme in Waschmitteln oder der Lebensmittelindustrie) oder in organisch-chemischen Transformationen (technisch oder auch nur im Labormaßstab) verwendet.

Wir interessieren uns sowohl für die Aufklärung des Reaktionsmechanismus von natürlichen Enzymen als auch um die Wirkweise sowie das Engineering von Enzymen für die Biokatalyse. Für den erstgenannten Punkt sei auf die auf dieser Seite beschriebenen Enzymmechanismen der NTPDasen und von CD73 als Beispiele verwiesen. Zwei im folgenden näher beschriebene Projekte der Biokatalyse sind die flavinabhängigen Monooxygenasen für stereospezifische organische Transformationen und Enzyme für den umweltfreundlichen Abbau von PET-Kunstoffen (Polyethylenterephthalat), sogenannte PETasen.

Faltung einer thermostabilen PET-Hydrolase (links) und Schema der katalysierten Reaktion (rechts). Bild: Universität Leipzig, BBZ-Strukturanalytik

Polyethylenterephthalat (PET) ist ein vielverwendeter Kunststoff, wobei die PET-Flasche sicher das bekannteste Produkt ist. Die Verschmutzung der Umwelt durch Kunststoffe ist ein inzwischen zunehmend erkannte Herausforderung. Lösungen dazu können in einem umweltfreundlicher und effektiver Abbau für ein Recycling oder zu weniger belastenden Reaktionsprodukten liegen. Ein Problem ist dabei die hohe Stabilität von Kunststoffen wie PET in der Umwelt. Enzyme sind auf der anderen Seite für ihre enorme Aktivität unter umweltgerechten Reaktionsbedingungen (Umgebungstemperatur, Wasser als Lösungsmittel) bekannt. In der Tat gibt es in der Natur Enzyme, die PET unter milden Bedingungen effizient hydrolysieren können.

Wir haben 2014 in Kooperation mit der Gruppe von Wolfgang Zimmermann in Leipzig die erste Struktur einer thermostabilen PET-Hydrolase aufgeklärt, um die strukturelle Grundlage der Funktionsweise dieses Enzyms zu verstehen. Diese Enzyme stellen inzwischen einen Fokus weltweiter Forschungsaktivitäten in der Biokatalyse dar. Ziel ist es die Effektivität der Enzyme immer weiter zu steigern, wobei das Durchmustern von Bibliotheken natürlicher Enzyme oder Gene, Zufallsmutagenese sowie strukturbasiertes Enzymdesign als Methoden eingesetzt werden. Auch wir forschen in Kooperation mit Christian Sonnendecker und Wolfgang Zimmermann weiter an plastikabbauenden Enzymen.

Publikationen

C. Roth, R. Wei, T. Oeser, J. Then, C. Föllner, W. Zimmermann, N. Sträter
Structural and functional studies on a thermostable polyethylene terephthalate degrading hydrolase from Thermobifida fusca
Appl. Microbiol. Biotechnol. 2014, 98, 7815-7823.

Strukturbasierte Wirkstoffentwicklung

Bindungsmodus des Inhibitors AB680 an CD73 (links) und Strukturformeln der Inhibitoren PSB12489 und AB680 (rechts). Bild: Universität Leipzig, BBZ-Strukturanalytik

Das Enzym CD73 spaltet extrazelluläres AMP zu Adenosin und Phosphat und es ist die Hauptquelle des immunsuppressiv wirkenden Adenosins. Viele Tumore überexprimieren das Enzym, um so der Immunreaktion des Wirts zu entkommen. Die Hemmung von CD73 durch Antikörper oder synthetische Kleinmoleküle wurde daher als vielversprechender Ansatz für die Krebs-Immuntherapie erkannt. Mehrere Antikörper und einige organische Moleküle befinden sich gegenwärtige in klinischen Phasen der Erprobung.

Wir haben die Entwicklung von Kleinmolekülinhibitoren von CD73 ausgehend von dem ADP-Analogon AMPCP (siehe auch die Abbildung oben im Kapitel zu CD73 in der extrazellulären Signaltransduktion) begleitet. Die Gruppe um Christa Müller von der Universität Bonn hat Derivate des AMPCP entwickelt, in denen ein Chlorsubstituent am C2-Atom und eine Benzylgruppe an der Aminogruppe des Adenins die Affinität  von 88 nM für AMPCP auf 0.32 nM für PSB12489 gesteigert werden konnte. Die Verbindung AB680, entwickelt von Arcus Biosciences, die als erste Kleinmolekülverbindung in klinische Phasen eingetreten ist, hemmt CD73 sogar mit 5 pM. Die Abbildung zeigt den von uns bestimmten Bindungsmodus von AB680 an CD73.

In aktueller Forschung untersuchen wir die Bindung weiterer verbesserter oder alternativer Inhibitoren, wobei zum Beispiel auch Pyrimidine als Nucleobase anstelle des Adenins eingesetzt werden.

Literatur

  • S. Bhattarai, J. Pippel, E. Scaletti, R. Idris, M. Freundlieb, G. Rolshoven, C. Renn, SY Lee,  A. Abdelrahman, H. Zimmermann, A. El-Tayeb, C.E. Müller, N. Sträter.
    2-Substituted α,β-Methylen -ADP Derivatives: Potent Competitive Ecto-5'-nucleotidase (CD73) Inhibitors with Variable Binding Modes.
    J. Med Chem. 
    2020, 63 (6): 2941-2957.
     
  • S. Bhattarai, J. Pippel, A. Meyer, M. Freundlieb, C. Schmies, A. Abdelrahman et al.      
    X-Ray Co-Crystal Structure Guides the Way to Subnanomolar Competitive Ecto-5'-Nucleotidase (CD73) Inhibitors for Cancer Immunotherapy 
    Advanced Therapeutics 2019, 2 (10), 1900075.

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